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生物膜（biofilm）也稱為生物被膜，是指附著于有生命或無生命物體表面被細菌胞外大分子包裹的有組織的細菌群體。由于生物膜在環(huán)境中隨處可見，對抗生素抗性很強，因此，生物膜形成機理及調(diào)控吸引了很多研究人員的注意。我們使用土壤細菌，熒光假單胞菌作為模式生物，研究如何控制這種細菌生物膜的形成。

Shiro Yoshioka 說：“Phenom ProX 和 ParticleMetric 軟件結合使用，有效地統(tǒng)計出生物膜中的桿形細菌的尺寸信息”

轉(zhuǎn)座子突變通常用于標識所需的生物膜形成的基因。將轉(zhuǎn)座子插入到參與生物膜的形成的基因中，該突變體可以顯示基于這種基因，生物膜形成增加或減少情況。通過這種技術，我們找到了負責合成細菌第二信使的一種基因。

相對于與野生型菌株，c-di-GMP 的損失引起了生物膜形成的減少。在本次研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，破壞 de novo 嘌呤核苷酸生物合成的一個基因也可以引起生物膜形成的減少。因為這種基因?qū)τ谏锖铣赏緩缴系闹匾栽诙喾N細菌上被報導，我們研究了這些突變體，弄清了這種生物合成途徑與熒光假單胞菌生物膜形成之間的關系。

Phenom ProX 對于生物膜研究的應用

雖然突變體形成的生物膜減至不到 WT 的一半，細胞計數(shù)實驗表明，生物膜中的突變細胞數(shù)目與 WT 相當。要解釋這一結果，我們推測突變體在生物膜中的細胞尺寸變得比 WT 更小。換句話說，突變引起生物膜細胞細胞尺寸減少。這種假設也有依據(jù)，因為突變體不能合成 AMP 和 GMP，可能導致突變體的增長放緩。

掃描電子顯微鏡 (SEM) 是檢查細菌生物膜中細胞大小的*方法之一。為了獲取有關生物膜中細菌細胞的尺寸信息，我們使用一個桌面掃描電鏡，Phenom ProX，使得我們可以樣品制備后的一分鐘內(nèi)獲得掃描電鏡圖像。這快的速度使得我們可以針對每個突變采集多張顯微照片以便通過 ParticleMetric 軟件進一步詳細分析。圖 1 為 Phenom ProX 拍攝的熒光假單胞菌清晰的圖片。

圖 1

生長在聚氯乙烯表面熒光假單胞菌生物膜細胞的掃描電鏡圖像 (放大倍率︰ 12，000 x)

飛納電鏡 Phenom ParticleMetric 軟件的強大力量

掃描電鏡圖像比較明確顯示出突變體的尺寸發(fā)生了減小。然而，它很難定量描述 WT 和突變體細胞大小的區(qū)別。Phenom ProX 的 ParticleMetric  軟件能夠快速識別掃描電鏡圖像中的每個細胞的各種參數(shù)。因為熒光假單胞菌是桿形的，外接的圓直徑可以很好的近似為細胞的長度。使用此軟件，我們從幾個掃描電鏡圖像中收集超過 1,500 的單個細胞的外接的圓直徑，創(chuàng)建直方圖，并計算相關的外接的圓直徑 (圖 2) 中位數(shù)。

Phenom ParticleMetric  軟件自動執(zhí)行此過程。我們*的關注點的是自動顆粒檢測有時將聚集細胞視為單個細胞。ParticleMetric 允許直觀地從數(shù)據(jù)中移除這種細胞。計算的結果顯示，該突變細胞的長度相對于 WT 比縮減了 25 ~ 30%。因此，Phenom ProX 和 ParticleMetric 軟件的證據(jù)，成功地證明了我們做出的“突變的細胞在生物膜中相對于 WT 變得更小”的假設。

圖 2
ParticleMetric 軟件生成的統(tǒng)計了超過 1,500 個熒光假單胞菌生物膜細胞的外接圓直徑的直方圖，外接的圓直徑的中位數(shù)計算結果是 1.79µm，除了直方圖，也可以顯示任何一個選定細胞的參數(shù)

結論

Phenom ProX 桌面掃描電鏡和 ParticleMetric 軟件有效地統(tǒng)計了生物膜內(nèi)細菌細胞的大小數(shù)據(jù)，對生物膜研究中的應用提供有價值的信息。因為許多細菌由于養(yǎng)分有效性或抗生素而改變它們的大小和形態(tài)，在細胞的大小和形態(tài)的識別與統(tǒng)計將是未來的研究在生物膜研究的必要條件。Phenom ProX 和簡單易用快速的 ParticleMetric 軟件將為微生物的研究人員提供很大的幫助。